Интерпретация результатов ПЦР

     
     
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Области применения анализа

В настоящее время в медицине и криминалистике, а также для клонирования генов и установления родственных связей применяют более десятка разновидностей амплификации. В ежедневной практике кровь на ПЦР назначают медицинские специалисты:

  • педиатр;
  • гинеколог;
  • уролог;
  • дерматовенеролог;
  • инфекционист;
  • фтизиатр;
  • пульмонолог.

Генно-молекулярная диагностика успешно применяется в неонатологии. С помощью полимеразной цепной реакции выявляют возможное заражение младенцев внутриутробно и сразу после появления на свет. Для детей с риском инфицирования анализ проводят в первые 48 часов после рождения и повторно в возрасте 3-6 месяцев.

Кроме инфекционных заболеваний, Рolymerase Сhain Reaction помогает диагностировать наследственные аномалии и мутации. В перинатальный период методом ПЦР у будущего малыша можно обнаружить:

Области применения анализа
  • гемофилию – нарушение свертываемости крови;
  • болезнь Хантера – патологии обменных процессов;
  • мусковидоз – нарушение внешнесекреторной функции желез;
  • нервно-мышечную миодистрофию Дюшенна-Беккера;
  • первичный иммунодефицит;
  • синдром Альпорта – патологию почек.

PCR используют для определения мутантных генов и их РНК-продуктов в диагностике онкологических заболеваний. Высокая чувствительность молекулярного метода обеспечивает выявление онкопатологий в доклинической стадии, когда очаг опухоли не превышает 0,01 см3 в размерах.

Анализ крови на ВПЧ

По обнаруженным онкогенам, биологическим канцерогенам и антионкогенам диагностируют исходную стадию:

  • онкогематологических болезней (рака крови и лимфатической системы);
  • злокачественных образований молочных желез;
  • аденокарциномы толстой кишки;
  • меланомы;
  • рака ротоглотки;
  • наследственных форм рака.

Высокой онкогенностью обладают штаммы 16, 18, 31, 33, 35 ВПЧ (вируса папилломы человека). В 50% случаев вызывают карциному шейки матки у женщин – раковую опухоль эпителиальных клеток. Обнаружение неопластических клеток в доклинической стадии рака значительно повышает шансы на успешное лечение болезни.

Области применения анализа

Особую ценность ПЦР имеет для Службы крови. Метод позволяет определить заражение гепатитами, ВИЧ, сифилисом в бессимптомный инкубационный период. На этой стадии иммунная система еще не продуцирует антитела к возбудителям, и выявить заболевания с помощью серологических исследований невозможно.

Проверка донорской крови ПЦР предупреждает возможное инфицирование реципиента

Что можно измерить с помощью ПЦР в реальном времени?

Если вам необходимо проанализировать экспрессию генов, ПЦР в реальном времени может показать количество мРНК в образцах. В результате реакции амплифицируется небольшой регион мРНК, с помощью олигонуклеотидов и флуоресцентного зонда (как в методике TaqMan). Амплификатор (прибор, в котором происходит ПЦР) измеряет интенсивность флуоресценции зондов в образцах на протяжении каждого цикла. На первых циклах уровень флуоресценции недостаточен, чтобы его мог детектировать прибор, но при дальнейшем прохождении реакции он возрастает многократно. Кривая амплификации имеет так называемую экспоненциальную фазу, после которой следует фаза плато.

Ct (пороговый цикл) обозначает определенный цикл реакции и представляет собой одно из ключевых значений ПЦР в реальном времени. Пороговый цикл наступает, когда график кривой амплификации переходит в экспоненциальную фазу (на этой фазе отрезок кривой амплификации линейный). Порог (порог чувствительности, пороговое значение), который обозначен на рисунке красной прямой, пересекает кривую амплификации в точке наступления экспоненциальной фазы. Порог чуствительности может быть разным для разных видов анализа (если, например, используются разные методики анализа или исследуются разные гены), но всегда одинаковый для всех образцов в одной выборке (или в одном эксперименте).

Суть ПЦР в реальном времени заключается в том, что в каждом цикле реакции количество продукта удваиватся по сравнению с предыдущим. Если, например, значение Ct для двух реакций отличается на 2 цикла (см. рисунок), можно сделать вывод, что в образце А (обозначен фиолетовым графиком) в 4 раза больше копий мРНК, чем в образце Б (обозначен оранжевым графиком).

Чаще всего, данные, полученные в результате ПЦР в реальном времени, позволяют оценить так называемую «относительную экспрессию», то есть, насколько различается интенсивность экспрессии определенного гена у двух организмов. Однако, методика позволяет оценить и абсолютное значение экспрессии генов, но для этого необходимо создать стандарт, в роли которого обычно выступают  клонированные целевые участки кДНК, интегрированные в вектор.

О чем расскажут результаты

Результаты готовятся в течение 10–14 дней. Это время необходимо для того, чтобы вырастить колонию бактерий, а затем их изучить. Расшифровка обычно состоит из двух бланков: непосредственно данные о наличии тех или иных бактерий и антибиотикограмма, т. е. информация о чувствительности микрофлоры к антибиотикам.

Бланк результатов включает информацию об обнаруженных микроорганизмах, которые указаны в КОЭ. Чем выше КОЭ, тем больше концентрация тех или иных бактерий в одном мл жидкости. Обычно КОЭ имеют верхние и нижние пределы, превышение которых говорит о том, что в организме развивается воспалительный процесс.

Антибиотикограмма включает информацию обо всех видах бактерий, которые присутствуют в урине человека. Напротив каждого представителя патогенной микрофлоры стоит информация о том, обнаружен ли данный данный вид в исследуемом материале. Также в обязательном порядке содержится информация о том, к каким видам антибиотиков у них имеется чувствительность.

Благодаря первому пункту расшифровки лечащий врач сможет определить, имеются ли у пациента заболевания, второй поможет выявить возбудителя болезни и поставить правильный диагноз. Благодаря третьему пункту расшифровки специалист сможет максимально верно выбрать препараты для лечебной терапии.

Так как урина нестерильна, в допустимых пределах бактерии в ней присутствуют. При расшифровке полученных данных врач в первую очередь изучает их количество. Если общее число микроорганизмов не превышает отметки в 1000 КОЭ/мл, можно с уверенностью сказать, что пациент здоров. Показания, превышающие отметку в 100 000 КОЭ/мл, свидетельствуют о развитии инфекционного заболевания и требуют соответствующего лечения. Промежуточные данные требуют повторного проведения исследования. Обычно это свидетельство несоблюдения требований к сбору биоматериала, реже – информация о начале воспалительного процесса.

Сохраните ссылку чтобы не потерять, она Вам понадобиться:

Нет похожих записей.

Виды и результаты ПЦР

Полимеразная цепная реакция способна отразить не только наличие возбудителя, но также его примерную концентрацию в единице биоматериала (например, 1 мл крови, мочи, слюны). Выявление, а также идентификация бактерий либо вируса называется качественным ПЦР-анализом. Он может дать только 2 варианта ответа — есть возбудитель в организме или нет.

Это уместно для диагностики заболеваний даже на ранних сроках после заражения. С помощью ПЦР можно проверить наличие инфекции в крови в инкубационном периоде развития или во время «серологического окна» (когда иммунитет еще не выработал антитела, а ИФА-тест отражает отрицательный результат, несмотря на высокую вероятность заражения). Нормой по всем возбудителям считается отрицательный результат. Если он положительный — в организме есть инфекция.

Чтобы оценить концентрацию болезнетворных агентов, проводят количественные ПЦР анализы. Они указывают, сколько именно копий РНК или ДНК возбудителя обнаружено в расчете на единицу измерения биоматериала. Результат указывают в международных единицах (МЕ/мл). Количественный тест определяет:

  • вирусную или бактериологическую нагрузку на организм;
  • степень активности инфекции;
  • необходимость начала терапии;
  • эффективность назначенного лечения.
Виды и результаты ПЦР

Качественный и количественный ПЦР одинаково важны при диагностике и лечении ВПЧ, ВИЧ, гепатита С. При перечисленных заболеваниях назначают мощные противовирусные препараты, а контроль изменения концентрации возбудителя позволяет корректировать дозы, снижая риск развития побочных эффектов. Хорошим анализом считается такой, результат которого приближен к минимальному порогу чувствительности теста (10-50 МЕ/мл), однако это не исключает необходимости продолжать терапию.

Читайте также:  Ureaplasma species, ДНК количественно [реал-тайм ПЦР]

Информативность ПЦР анализа и его точность актуальны при диагностике многих заболеваний. Однако метод этот сложный, а его выполнение требует строгого соблюдения техники и правил. В противном случае возможно получение не достоверного результата (ложного). Ложноположительные данные получаются при:

  • попадании в пробу соскоба крови;
  • загрязнениями биоматериала примесями эпителия и слизи;
  • нарушении стерильности условий проведения анализа.

Ложноотрицательный результат теста возможен при неправильной транспортировке проб в лабораторию (нарушения температурного режима, воздействие внешних условий), применении непригодных для анализа реактивов.

Посев на аэробную и факультативно-анаэробную бактериальную флору с определением чувствительности к основному спектру антимикробных препаратов и бактериофагам

Взятие материала проводится до начала антибактериальной терапии или не ранее, чем через 2 недели после ее окончания.

Правила взятия биоматериала

  • взятие материала из уретры не ранее, чем через 3  часа после последнего мочеиспускания,
  • из цервикального канала и влагалища — вне менструации,
  • взятие секрета  предстательной железы  проводится после  тщательного туалета  наружного отверстия головки полового члена (водой с мылом), секрет собирают после массажа предстательной железы (врачебная процедура),
  • взятие эякулята проводится после  тщательного туалета  наружного отверстия головки полового члена (водой с мылом),  после мастурбации сначала в стерильный контейнер с завинчивающейся крышкой, затем зонд-тампон пропитывают биоматериалом в течение 5 сек. и помещают его в пробирку, обламывают по метке и плотно закрывают крышкой.

В лабораторию необходимо доставить пробирку с крышкой оранжевого или фиолетового цвета, с жидкой средой AMIES, с зонд-тампоном, пропитанным биоматериалом (пробирку можно получить в регистратуре CMD). Доставка в лабораторию в день взятия биоматериала.

Метод исследования: Микробиологический

Исследование позволяет оценить качественный и количественный состав аэробной и факультативно-анаэробной микрофлоры исследуемого биоматериала и оценить чувствительность микроорганизмов к основному спектру антибиотиков, что позволит врачу назначить адекватную терапию. Нормальная микрофлора человека представляет собой совокупность микроорганизмов. При развитии патологических процессов состав микроорганизмов изменяется в сторону увеличения условно-патогенных и/или появления патогенных возбудителей.

Исследование направлено на обнаружение роста этиологически значимых бактерий:

  • энтеробактерий (родов Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus и др.);
  • неферментирующих грамотрицательных бактерий (родов Pseudomonas, в т.ч. Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, Moraxella и др.);
  • стрептококков (Streptococcus agalactiae (group B), Streptococcus pyogenes (group A) и др.);
  • энтерококков (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и др.);
  • стафилококков (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus и др.);

Идентификация микроорганизмов выполняется новым автоматизированным методом с использованием современных технологий на масс-спектрометре Microflex (Bruker).

На следующем этапе лабораторного исследования выполняется определение чувствительности возбудителя к лекарственным препаратам на современных микробиологических анализаторах.

Выбор спектра антибиотиков зависит от выявленного возбудителя и соответствует стандартам CLSI (Институт клинических и лабораторных стандартов), США и EUCAST (Европейский комитет по определению чувствительности к антимикробным препаратам (European Committee Antimicrobial Susceptibility Testing).

Показания к исследованию:

  • Наличие симптомов инфекционно-воспалительных заболеваний
  • Подбор антибактериальной терапии;
  • Оценка эффективности антибактериальной терапии.

Интерпретация результатов:

  • Результат бактериологического исследования стандартизирован и выдается в соответствии с выявленными этиологически значимыми микроорганизмами в количественном формате, в единицах измерения КОЕ/тамп, содержит антибиотикограмму и заключение, помогающее лечащему врачу лучше сориентироваться в предоставленной информации.
  • Производитель бактериофагов: ФГУП “НПО “Микроген” Минздрава России, , Пермь, Уфа
  • Интерпретация проводится врачом с учетом клинических проявлений.
Читайте также:  Муцинозный рак яичников: основные признаки, методики лечения, прогноз

Внимание! Чувствительность к спектру антибиотиков проводится в случае обнаружения роста патогенной флоры, выявленной в любом количестве и условно-патогенной флоры в количестве более 104 КОЕ/тамп.

Обращаем Ваше внимание на то, что интерпретация результатов исследований, установление диагноза, а также назначение лечения, в соответствии с Федеральным законом № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 года, должны производиться врачом соответствующей специализации.

Проведение ПЦР

ПЦР исследование, что это такое? ПЦР диагностика проводится в специальном аппарате – амплифакторе. Это прибор, в который устанавливаются пробирки с биологическими пробами. В зависимости от исследования амплифактор настраивается на нужное количество циклов и начинает попеременно нагревать и охлаждать пробирки, в которых в это время идут реакции. При этом создаётся однородность температуры по всей внутренней камере, необходимая температура задается буквально в один миг и регулируется с точностью до 0,1 градуса.

Такая точность при нагреве и охлаждении необходима для того, что бы ни превысить пороговые значения и не испортить биоматериал.

Что необходимо для проведения, или, что определяет ПЦР:

  • Буферный раствор;
  • ДНК-матрица с содержанием искомого участка генов для амплификации;
  • Термоустойчивая ДНК-полимераза;
  • Ионы Mg2+;
  • Два коротких фрагмента нуклеиновой кислоты для запуска синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы.

Проведение ПЦР-анализа

8.1 ПЦР для выявления ДНК патогенных бактерий [родов Salmonella, Shigella, Cronobacter (Е. sakazakii), энтерогеморрагических Escherichia coli, термофильных Campylobacter spp., Listeria monocytogenes] осуществляется с использованием программируемого амплификатора и наборов реагентов по 4.3.1, обеспечивающих постановку любого их двух вариантов гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации — по конечной точке (FEP) и в режиме реального времени (FRT).

8.2 Постановку ПЦР для выявления ДНК бактерий родов Salmonella, Shigella, Cronobacter (E. sakazakii), энтерогеморрагических Escherichia coli, термофильных Campylobacter spp. осуществляют по схемам и алгоритмам, рекомендованным производителем комплектов реагентов с обязательным применением внутренних контрольных образцов с этапа экстракции ДНК.

8.3 Положительные результаты тестирования отрицательного контроля экстракции ДНК (стерильный образец питательной среды для селективного обогащения) могут быть связаны с загрязнением среды генетическим материалом тестируемого микроорганизма. В этом случае необходимо повторить анализ с этапа селективного обогащения с применением сред, не содержащих ДНК искомого микроорганизма, с дополнительным включением в панель в качестве отрицательного контроля выделения препарата ОКО из набора реагентов.

Мазок у мужчин

Подготовиться к забору мазка из мочеиспускательного канала для проведения ПЦР несложно. Достаточно соблюдать изложенные ниже правила.

Мазок у мужчин
  • За 2 суток до ПЦР обследования нужно начать воздерживаться от сексуальных отношений.
  • Прием лекарств прекращается приблизительно за 7 дней до проведения анализа, если, конечно же, они не были специально назначены врачом.
  • Гигиена половых органов должна проводиться накануне вечером, в день анализа ПЦР это делать не стоит.
  • Рекомендуется не мочиться примерно 2-3 часа перед сдачей анализа.
Мазок у мужчин

Мазок у мужчин

Особенности самостоятельного сбора секрета простаты

В настоящее время нетрудно провести микроскопическое и бактериологическое исследование. В любом большом населенном пункте есть лаборатория, специализирующаяся на выполнении таких анализов. Исследование платное, но стоимость доступная. Чтобы собрать секрет самостоятельно, нужно:

  • изучить технику массажа простаты;
  • подготовить герметично закрытую стерильную емкость;
  • привести быстро собранный секрет в клинику.

После получения результата можно посетить уролога. Обычно проводится анализ секрета простаты недолго.